MODELLO

2.2 Ambito della ricerca	2.3 Tipologia
Interistituto/Interdipartimento	Nuova ricerca

nº	Cognome	Nome	Qualifica	Facoltà	Ist./Dip.
1.	CHIRLETTI	Piero	PO	MEDICINA e CHIRURGIA	DIP. CHIRURGIA
2.	CODACCI PISANELLI	Giovanni	RU	MEDICINA e CHIRURGIA	DIP. MEDICINA SPERIMENTALE E PATOLOGIA
3.	NASO	Giuseppe	PA	MEDICINA e CHIRURGIA	DIP. MEDICINA SPERIMENTALE E PATOLOGIA

nº	Cognome	Nome	Qualifica	Facoltà	Ist./Dip.	Note
1.	DI FONZO	CONCETTA	Specializzando	MEDICINA e CHIRUR.II	Dip.MEDICINA SPERIMENTALE E PATOLOGIA
2.	FERRALDESCHI	ROBERTA	Altro	MEDICINA e CHIRUR.II	Dip.MEDICINA SPERIMENTALE E PATOLOGIA

nº	Cognome	Nome	Qualifica	Universita'/Istituzione	Ist./Dip.	Note
1.	PALOMBO	FABIO	Ricercatore	IRBM	Dip. Biologia Cellulare e Molecolare

2.5 Inquadramento della ricerca proposta (in ambito nazionale ed internazionale)

Il trattamento chemioterapico dei carcinomi dell’esofago e dello stomaco ottiene dei risultati insoddisfacenti. E’ infatti frequente osservare la rapida comparsa di fenomeni di resistenza ai farmaci legati a modificazioni dell’espressione dei geni. Questi fenomeni possono essere studiati utilizzando l’analisi del quadro di espressione genica mediante micro-arrays. L’obiettivo di questo studio è quello di analizzare il profilo di espressione dei geni prima e dopo un trattamento chemioterapico al fine di identificare un pattern in grado di fornire indicazioni rilevanti per la prognosi e per il trattamento dei pazienti.

Situazione attuale della materia
I carcinomi dell’esofago e dello stomaco presentano una prognosi sfavorevole: in parte questo è dovuto a motivi anatomici, ed al frequente coinvolgimento di strutture vitali appena la malattia si estende all’esterno della parete dell’organo. D’altra parte l’efficacia della chemioterapia è limitata. Anche se la percentuale di risposte è relativamente elevata, rispetto ad altre neoplasie, la sopravvivenza mediana dei pazienti con malattia avanzata è inferiore ai 12 mesi. Ad oggi, inoltre, non è stato identificato con certezza un trattamento chemioterapico efficace come “adiuvante” dopo l’asportazione chirurgica del tumore. I dati pubblicati da McDonald e collaboratori sul prestigioso New England Journal of Medicine, che riguardano un trattamento combinato radio-chemioterapico, presentano numerosi aspetti che non li rendono generalizzabili.
Questi aspetti sottolineano come sia rilevante il problema della insorgenza di fenomeni di resistenza ai farmaci. Questo fenomeno è attribuibile a modifiche dell’espressione di determinati geni: in passato sono stati condotti numerosi studi in cui sono stati studiati singolarmente quei geni che erano più direttamente coinvolti con l’azione di determinati farmaci. L’esempio più caratteristico è lo studio della Timidilato Sintetasi (TS) riguardo all’efficacia del fluorouracile. Questi studi hanno dato dei risultati interessanti, ma incompleti. In primo luogo è raro che il fluorouracile sia utilizzato singolarmente, inoltre anche in questi casi la sensibilità o resistenza al farmaco coinvolge il complesso macchinario intracellulare, ed analizzare un singolo gene (o la sua proteina) non è sufficiente per avere un esauriente quadro informativo.
La ricerca si è quindi spostata verso l’analisi integrata del livello di espressione di numerosi geni in modo da ottenere un pattern di espressione di diverse centinaia di molecole di RNA messaggero.
Questa tecnologia richiede l’integrazione delle tecniche di biologia molecolare più sofisticate con l’acquisizione dei dati e la loro analisi dal punto di vista statistico. L’applicazione di queste tecnologie all’oncologia clinica è stata realizzata in diverse patologie, in particolare alle leucemie ed al carcinoma della mammella. Anche se queste metodiche non sono ancora utilizzate nella routine è evidente che il loro ruolo è progressivamente più ampio. E’ possibile aspettarsi che l’evoluzione della tecnica, accompagnata magari da una riduzione dei costi, porterà queste metodiche in un numero sempre più ampio di laboratori di diagnostica.

Il programma di ricerca che viene presentato è diretto ad utilizzare la tecnologia dell’analisi dei micro-arrays per ottenere dei dati rilevanti nella formulazione della prognosi e nella scelta del trattamento dei pazienti affetti da carcinoma dell’esofago o dello stomaco.
Da notare che attualmente nel database Medline non sono registrati “studi clinici” relativi all’uso dei microarrays in pazienti affetti da carcinoma dell’esofago o dello stomaco.
Si procederà all’analisi di un campione di tessuto ottenuto prima del trattamento mediante biopsia endoscopica, quindi il paziente verrà trattato con una associazione di due farmaci per 3 cicli. Dopo questo tempo verrà prelevato un nuovo campione di tessuto mediante biopsia o, se il paziente è operabile, mediante campionamento del pezzo operatorio.
Verranno studiati due protocolli di chemioterapia: Taxotere-Oxaliplatino e Taxotere-Irinotecan. Entrambi i protocolli verranno somministrati ogni tre settimane.
I dati ottenuti dall’analisi del profilo di espressione genica verranno utilizzati sia in quanto tali che in un’analisi comparativa tra il profilo rilevato prima e dopo il trattamento. La raccolta di questi dati permetterà di realizzare diversi confronti:
1. Confronto tra il pattern di espressione genica iniziale e la risposta alla chemioterapia
2. Confronto tra il pattern di espressione genica iniziale e la risposta ad una delle due associazioni chemioterapiche.
3. Confronto tra il pattern di espressione genica iniziale ed i decorso della malattia sia come durata che come incidenza di determinate localizzazioni di metastasi
4. Modificazione del pattern di espressione genica determinato dalle due associazioni chemioterapiche
5. Relazione tra alterazione del profilo di espressione genica (pre- e post-trattamento) e decorso della malattia
6. Identificazione dei geni che dovessero presentare una particolare variazione nel profilo di espressione.

L’obiettivo principale di questo studio è l’identificazione di un pattern di espressione genica della neoplasia, o di una modificazione del pattern indotto da chemioterapia, associato con una maggiore probabilità di sensibilità o di resistenza al trattamento con chemioterapia, o con uno dei due protocolli di chemioterapia oggetto di studio. In questo modo sarà possibile selezionare i pazienti in modo da assegnare il trattamento che ha la maggiore probabilità di risposta e, se opportuno, evitare la somministrazione di un farmaco con scarsa probabilità di essere attivo in quanto l’inevitabile tossicità sarebbe sproporzionata al beneficio atteso.

2.6 Sintesi del programma di ricerca e descrizione dei compiti dei singoli partecipanti

Riassunto
Questo studio si propone di valutare l’attività di due regimi di chemioterapia sul carcinoma dell’esofago e dello stomaco sia in termini di riduzione della massa tumorale che di alterazioni del profilo di espressione genica. Nel corso della endoscopia preoperatoria verranno prelevati dei frammenti di tessuto su cui verrà condotto lo studio del profilo genetico mediante micro-arrays. I pazienti verranno quindi trattati con l’associazione di Taxotere ed Oxaliplatino o di Taxotere ed Irinotecan per tre cicli. Al termine del trattamento verrà studiato nello stesso modo un nuovo frammento di tessuto prelevato nel corso di una nuova endoscopia o dal pezzo operatorio. Si procederà quindi a valutare il pattern di espressione genica, e la sua modificazione dopo trattamento, per cercare degli elementi che siano predittivi di riposta o di resistenza al trattamento e/o prognostici.

Introduzione
La chemioterapia del carcinoma dello stomaco e dell’esofago ottiene dei risultati insoddisfacenti nella malattia avanzata nonostante sia possibile ottenere una risposta obiettiva in una percentuale non trascurabile dei pazienti. Queste caratteristiche suggeriscono che sia possibile utilizzare la chemioterapia prima dell’intervento chirurgico allo scopo di ridurre l’estensione della malattia e di eliminare eventuali focolai micrometastatici già presenti al momento dell’intervento ma non ancora visibili con le comuni metodiche di indagine.
Un trattamento pre-operatorio dà inoltre la possibilità di studiare le caratteristiche del tessuto tumorale prima e dopo la somministrazione dei farmaci, e di studiare le modificazioni che vengono indotte. Recentemente le caratteristiche del tessuto possono essere valutate mediante lo studio di un grande numero di geni utilizzando la tecnologia dei microarrays.

Pazienti e Metodi
Pazienti: saranno studiati pazienti affetti da carcinoma dell’esofago o dello stomaco che possano giovarsi di un trattamento chemioterapico pre-operatorio.
Saranno utilizzati i comuni criteri di inclusione (età compresa tra 18 e 70 anni, buone condizioni generali [PS 0 o 1], capacità di esprimere un consenso informato, adeguata funzione del midollo osseo) e di esclusione (presenza di patologie non adeguatamente controllate a carico dell’apparato cardiovascolare, gastroenterico, rene o sistema nervoso centrale o periferico).
Trattamento chemioterapico
I pazienti verranno assegnati al trattamento con Taxotere-Oxaliplatino o con Taxotere-Irinotecan. Il trattamento verrà somministrato in un giorno ogni tre settimane e ripetuto per tre volte. Insieme ai farmaci antitumorali verranno somministrati nel giorno della terapia e nei giorni precedenti e seguenti gli opportuni trattamenti diretti a ridurre le tossicità acute e croniche.
Valutazione clinica strumentale e di laboratorio.
Prima del trattamento chemioterapico: endoscopia con prelievo tessutale per la diagnosi istologica, TAC torace-addome-pelvi, dosaggio dei markers tumorali.
Dopo il trattamento chemioterapico: endoscopia con prelievo tessutale per la diagnosi istologica, TAC torace-addome-pelvi, dosaggio dei markers tumorali
Tutti gi accertamenti vengono condotti con l’obiettivo di ottenere la più accurata stadiazione del paziente sia al momento dell’arruolamento che dopo il trattamento. Non sono previsti accertamenti strumentali o di laboratorio aggiuntivi riguardo a quelli previsti dalla ottimale gestione clinica di un paziente con le caratteristiche descritte nei criteri di inclusione/esclusione.

Studi di biologia molecolare
Al fine di rilevare le variazioni di espressione del maggior numero di geni possibile, verranno utilizzati i “microarray” che consentono di valutare contemporaneamente circa 50000 trascritti. Tale numero si avvicina alle più recenti stime del numero totale dei geni umani (35000-120000). Nel tumore alla mammella il profilo di espressione genica determinato per microarray ha permesso di identificare il gruppo di pazienti che avrebbe risposto alla terapia.
Per ottenere un informazione più specifica, il tumore verrà frazionato e il profilo di espressione verrà ricavato partendo solo dall’epitelio tumorale eliminando stroma, infiltrati linfocitari e cellule endoteliali derivate dalla neovascolarizzazione. Se un’analisi del tumore in toto, che includa tutte le componenti del tumore, ha un indubbio valore diagnostico e prognostico, le strategie antitumorali risulteranno più specifiche ed efficaci partendo da un profilo di espressione genica focalizzato esclusivamente sulle cellule tumorali. Inoltre la dissezione del tumore ridurrà la variabilità biologica e quindi porterà ad una maggiore riproducibilità dei dati nei diversi pazienti. Questo concetto si può riscontrare in un recente lavoro dove l’analisi di 9216 geni ha mostrato che 44 geni erano sovra-espressi e 191 sotto-espressi in un gruppo di 8 tumori. Grazie all’accuratezza dei dati questo risultato è stato poi confermato dagli stessi autori in altri 12 tumori usando un sotto-insieme di questi geni con un’analisi semi quantitativa.
Sebbene i microarray forniscano un analisi globale dell’espressione genica, non sono considerati un metodo quantitativo. Nel nostro laboratorio intendiamo riconfermare anche in termini quantitativi le variazioni di espressione osservate attraverso un’analisi con la PCR quantitativa. In ultimo la specificità di espressione sarà confermata, quando possibile, con l’immunoistochimica.

Obiettivi
Lo studio si propone di ottenere dei dati di utilità clinica in termini sia di attività della combinazione che di identificazione di parametri prognostici e/o predittivi.
Aspetti clinici
Risposta clinica: questa verrà valutata con i consueti criteri RECIST in base al cambiamento delle dimensioni e delle caratteristiche tomodensitometriche delle lesioni. A questi aspetti dimensionali verranno aggiunti i dati ottenuti dall’aspetto morfologico della lesione, come rilevati al momento dell’endoscopia, ed eventualmente la risposta dell’esame istologico.

Risposta istologica: questo elemento viene considerato tra i parametri di valutazione delle risposta in quanto è possibile che dopo il trattamento vi sia una risposta clinica completa, con la scomparsa di ogni lesione visibile sia alla TAC che alla endoscopia.

Modificazioni del quadro genetico.
Si tratta dell’aspetto più innovativo ed interessante dello studio. L’obiettivo è quello di identificare markers genetici prognositici e/o predittivi di risposta o di resistenza alla chemioterapia o ad uno dei due regimi. Si tratterà di valutare sia il pattern genetico iniziale che la sua evoluzione dopo trattamento. Qualora le variazioni più rilevanti dell’espressione genica si riferissero ad un numero limitato di geni si cercherà di caratterizzarli singolarmente e di chiarire il loro ruolo specifico.

Ruolo dei singoli partecipanti
Prof. Enrico Cortesi, Prof. Giuseppe Naso, Dott. Giovanni Codacci-Pisanelli: i medici del Day Hospital di Oncologia si occuperanno della effettiva somministrazione del trattamento chemioterapico e della gestione clinica dei pazienti in relazione ai controlli richiesti dal trattamento ed alla gestione delle complicanze del trattamento. Organizzeranno gli accertamenti strumentali e di laboratorio necessari per verificare la situazione della malattia al momento dell’arruolamento e la sua evoluzione dopo il trattamento chemioterapico.
Inoltre il dott. Codacci-Pisanelli si occuperà degli aspetti organizzativi e di raccordo relativi alla raccolta dei dati dei pazienti ed alla conservazione immediata dei prelievi bioptici ed all’invio del materiale allo IRBM per le analisi biologiche e molecolari.

Prof. Piero Chirletti. Il Prof. Chirletti è il chirurgo di riferimento per questo protollo: organizzerà l’endoscopia iniziale, necessarie per ottenere la diagnosi istologica, e quella che verrà effettuata dopo il trattamento per valutare l’evoluzione endolumninale della malattia.

Dott. Fabio Palombo. Dipartimento di Biologia Cellulare e Molecolare, IRBM, Pomezia, Roma. Il Dott. Palombo si occuperà della valutazione del profilo di espressione genica del tessuto, prima e dopo il trattamento chemioterapico, mediante analisi per microarrays. Presso lo IRBM verrà condotta sia la parte relativa alla amplificazione dello RNA che alla sua ibridizzazione, che infine l’analisi statistica dei dati.

3. Elenco delle migliori pubblicazioni negli ultimi 5 anni

A) Pubblicazioni su riviste scientifiche

1.	CORTESI E. (2003). Phase I/II trial of gemcitabine plus cisplatin and etoposide in patients with small-cell lung cancer LUNG CANCER. (vol. 39 pp. 331-38)
2.	CHIRLETTI P. (2000). impaired human gallbladder lipid absorption in cholesterol gallstone disease and its effects on cholesterol solubility in bile. GASTROENTEROLOGY. vol. 118, pp. 912-20.
3.	SOBRERO A; GUGLIELMI A; CIRILLO M; RECALDIN E; FRASSINETTI GL; ASCHELE C; RAVAIOLI A; TESTORE P; CAROTI C; GALLO L; PESSI MA; CORTESI E. (2001). 5-fluorouracile modulated by leucovorin, methotrexate and mitomycin: higly effective, low cost chemotherapy for advanced colorectal cancer BRITISH JOURNAL OF CANCER. in via di pubblicazione.
4.	ROILA F; CORTESI E. (2000). Dexamethasone alone or in combination with Ondansetron for the prevention of delayed nausea and vomiting induced by chemotherapy NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE. (vol. 21 pp. 1554-1559)
5.	CORTESI E. (2001). Multicenter phase II/III study of oxaliplatin plus cyclophosphamide vs cisplatin plus cyclophosphamide in chemonaive advanced ovarian cancer patients. ANNALS OF ONCOLOGY. (vol. 12 pp. 1411-5)
6.	DE BERARDINIS E, ANTONINI G, PETERS GJ, LOVES WJ, VAN DER BORN K, CODACCI PISANELLI G., DI SILVERIO F. (2004). Intravesical administration of gemcitabine in superficial bladder cancer: a phase I study with pharmacodynamic evaluation. BJU INTERNATIONAL. vol. 93, pp. 491-494 BJU Int.
7.	CODACCI PISANELLI G., VAN DER WILT CL, SMID K, NOORDHUIS P, PETERS GJ, VOORN D, PINEDO HM. (2002). High-dose 5-Fluorouracil with uridine-diphosphoglucose rescue increases thymidylate synthase inhibition but not 5-Fluorouracil incorporation into RNA in murine tumors. ONCOLOGY. vol. 62, pp. 363-370.
8.	PETERS GJ, BACKUS HH, FREEMANTLE S, VAN TRIEST B, CODACCI PISANELLI G., VAN DER WILT CL, SMID K, LUNEC J, CALVERT AH, MARSH S, MCLEOD HL, BLOEMENA E. (2002). Induction of thymidylate synthase as a 5-fluorouracil resistance mechanism. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. vol. 1587, pp. 194-206.
9.	SIROVICH I, KONOVALOVA N, CODACCI PISANELLI G., VOLKOVA LM, GIULIANI A, CICCONETTI F, SEMINARA P, MAZZOCCONI G, FRANCHI F. (1999). Activity of ruboxyl, a nitroxyl derivative of daunorubicin, on experimental models of colorectal cancer metastases. TUMOUR BIOLOGY. vol. 20, pp. 270-276.
10.	CHIRLETTI P. (2000). topographic diagnosis and surgical treatment of insulinomas. CHIRURGIA ITALIANA. vol. 52(1), pp. 11-16.
11.	AGLIANÒ AM, SANTANGELO C, SILVESTRI I, GAZZANIGA P, GIULIANI L, NASO G., FRATI L, CASTIGLIA R. (2000). On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. BLOOD. vol. 95 (11), pp. 3636-7.
12.	GRADINI R, REALACCI M, GINEPRI A, NASO G., SANTANGELO C, CELA O, SALE P, BERARDI A, PETRANGELI E, GALLUCCI M, DI SILVERIO F, RUSSO MA. (1999). Nitric oxide synthases in normal and benign hyperplastic human prostate: immunohistochemistry and molecular biology. JOURNAL OF PATHOLOGY. vol. 189 (2), pp. 224-9.
13.	PESCARMONA E, PIGNOLONI P, SANTANGELO C, NASO G., REALACCI M, CELA O, LAVINIA AM, MARTELLI M, RUSSO MA, BARONI CD. (1999). Expression of p53 and retinoblastoma gene in high-grade nodal peripheral T-cell lymphomas: immunohistochemical and molecular findings suggesting different pathogenetic pathways and possible clinical implications. JOURNAL OF PATHOLOGY. vol. 188 (4), pp. 400-6.
14.	CHIRLETTI P. (2001). Localized stage I-IIE aggressive non Hodgkin's lymphoma (NHL): Resulrs of prospective study with multimodality approach. ANTICANCER RESEARCH. vol. 121, pp. 4172.
15.	CORTESI E. (2002). Administration of low-dose interleukin-2 plus G-CSF/EPO early after autologous PBSC transplantation: effects on immune recovery and NK activity in a prospective study in women with breast and ovarian cancer BONE MARROW TRANSPLANTATION. (vol. 30 pp. 571-8)

Cognome .....................	Nome .....................
Qualifica .....................	Data di nascita .....................
Facoltà .....................	Ist/Dip......................
Indirizzo .....................
Telefono .....................	Fax .....................
E-Mail .....................

		Note (specificare in dettaglio le spese)
4.1 A) Totale spese per l'acquisto di apparecchiature scientifiche	€
4.2 B) Spese generali per la ricerca 4.2.1 Materiali di consumo e manutenzione strumenti (specificare il tipo di materiale e la strumentazione utilizzata)	€ 15.000	acquisto di chip per microarrays
4.2.2 Missioni - Seminari	€ 6.000	comunicazione a congressi dei risultati ottenuti
4.2.3 Raccolta, codifica e elaborazioni dati	€ 12.000	realizzazione ed aggiornamento di un database dedicato.
4.2.4 Altre voci:	€

TOTALE A+B	33.000

	Anno	Fondo assegnato	Fondo impegnabile
4.4.1	2000	Voce A	Voce A
		Voce B	Voce B
		Voce C	Voce C

1.	CARCINOMA DELLO STOMACO
2.	CARCINOMA DELL'ESOFAGO
3.	CHEMITOERAPIA NEOADIUVANTE
4.	PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA (MICROARRAYS)

1.	CODACCI PISANELLI G., DAMIANO ABENI, FRANCESCO CONCOLINO, RICCARDO BONO, MASSIMO LAURENZA, PAOLO RUATTI. (2002). CHANGES IN CARACHTERISTICS OF PATIENTS DIAGNOSED WITH MELANOMA, IDI-IRCCS, ROME, 1992-2000. 93rd Meeting of the American Association for Cancer Research. (vol. 43, pp. 1437).
2.	ANDREA ALIMONTI, FRANCESCO SATTA, M. DI PALMA, G. FERRETTI, P. PIERGROSSI, CODACCI PISANELLI G., V. ZOFFOLI, F. TODI, IDA PAVESE. (2004). The impact of cytokines circulating levels on cancer-related-fatigue. 95th Meeting of the American Association for Cancer Research. (vol. 45, pp. 1400).