Nei paesi industrializzati, la patologia diabetica mostra una chiara tendenza ad un aumento sia dell’incidenza sia della prevalenza. L’accresciuta prevalenza nel mondo del diabete tipo 2 (T2DM), soprattutto legata all’aumento del benessere ed allo stile di vita, ha portato l’OMS a parlare di vera e propria “epidemia”. Stime e proiezioni sul periodo 1994-2010 indicano la triplicazione a livello mondiale dei casi di T2DM. Per l'Europa Occidentale è stato previsto un aumento dei casi di T2DM del 27.5% dal 1994 al 2000 e del 54.9% dal 1994 al 2010. Il numero dei diabetici negli Stati Uniti (dove il diabete rappresenta la settima causa di morte) è salito da 1.6 milioni nel 1958 ad 8 milioni nel 1995, mentre in Italia la prevalenza è aumentata dal 2,5% (negli anni ’70) all’attuale 4-4,5%.
Un elemento che contribuisce significativamente all’elevata morbilità e mortalità cardiovascolare dei pazienti diabetici è rappresentato dallo sviluppo prematuro delle complicanze microvascolari e macrovascolari, queste ultime caratterizzate dalla malattia aterosclerotica dei vasi arteriosi coronarici, cerebrali e periferici. Nei pazienti con T2DM le morti per cause cardiovascolari costituiscono l’80% delle cause di decesso. Il motivo per cui l’aterosclerosi vascolare si sviluppa più precocemente e diffusamente nella popolazione diabetica rispetto a quella generale è continuo oggetto di studio ed è noto il contributo di molteplici fattori e meccanismi fisiopatologici strettamente legati alle alterazioni metaboliche determinate dalla malattia.
La stretta correlazione tra T2DM e la malattia aterosclerotica suggerisce che le due patologie potrebbero avere un background comune o delle alterazioni fisiopatologiche comuni che ne influenzano lo sviluppo e la progressione.
Sono state riportate evidenze biochimiche di un'attivazione piastrinica persistente nel paziente affetto da T2DM e che tale attivazione sia in larga misura dipendente dal controllo metabolico della malattia (Circulation 1999;99:224-9 e N Engl J Med 1990;322:1769-74). Inoltre, è ormai ampiamente accettato che citochine proinfiammatorie, molecole di adesione e chemochine sono implicate nella mediazione di quasi tutte le fasi della malattia aterotrombotica (J Intern Med 2002,252:283-94) e, in maniera del tutto analoga, nello sviluppo della malattia diabetica e delle sue complicanze (Circulation 2002;106:2067-72 e Circulation 2003;107:3199-203).
In questi ultimi anni si è venuto sempre più affermando il concetto di piastrina quale cellula infiammatoria: le piastrine attivate, infatti, sono in grado di rilasciare numerose sostanze di tipo pro-infiammatorio. È questo il caso del ligando per il CD40 (CD40L).
Il CD40L è una proteina transmembranaria di tipo II ed un membro della famiglia del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa). Nella membrana cellulare, esso è arrangiato in forma trimerica, in cui le diverse subunità sono tenute insieme da interazioni nei domini extracellulari della proteina (Nature 1993;361:539-541). Durante la risposta immunitaria, grazie alla sua omologia con il TNF, contribuisce alle interazioni con le cellule presentanti l’antigene ed allo switch isotipico delle immunoglobuline, svolgendo, quindi, un ruolo di primaria importanza nella risposta immunitaria (Nature 1993;361:539-541). Del tutto recentemente, si sono venute ad accumulare numerose prove sperimentali dell’esistenza del CD40L non solo sui linfociti, ma anche su altre cellule vascolari, potendo pertanto svolgere un ruolo chiave nell'infiammazione e nella trombosi.
La prima prova della presenza di CD40L nelle piastrine risale al 1998, quando Henn e coll. hanno dimostrato che questa citochina, criptica in piastrine non stimolate, è velocemente esposta sulla superficie della piastrina in seguito ad attivazione (Nat Med 2002;8:247-252). Il CD40L espresso sulla superficie viene successivamente clivato dalla membrana della piastrina (con meccanismi coinvolgenti forse delle metalloproteinase) con generazione di un frammento solubile (sCD40L)(Nature 1998;391:591-594). La possibilità che il CD40L possa fungere da agonista piastrinico è suggerita dalla sua capacità di interagire e stimolare la glicoproteina IIb/IIIa, fenomeni che portano al legame del fibrinogeno ed aggregazione piastrinica (Curr Opin Hematol 2003;10:356-361). Inoltre, è opinione comune che il CD40L, nella sua forma di membrana, ha la capacità di stimolare le piastrine a riposo legandosi al CD40 espresso sulla loro membrana, attraverso contatti cellula-cellula. Tuttavia, non esiste ancora un accordo se la forma solubile possa esercitare un simile effetto attivante, anche se alcuni autori hanno avanzato l’ipotesi che il sCD40L svolga un ruolo nell'attivazione piastrinica, rappresentando un ciclo di amplificazione auto-perpetuantesi (Circ Res 2003;92:1041-1048 e Blood 2001;98:1047-1054).
Nonostante le domande ancora aperte sulla natura delle interazioni CD40-CD40L nella fisiopatologia piastrinica, è ormai ampiamente accettato che sia il CD40L espresso sulla membrana sia la sua forma solubile (sCD40L) possono interagire con il CD40 espresso sulla membrana di cellule vascolari, provocando in tal modo risposte di tipo infiammatorio e/o protrombotico (Nature 1998;391: 591-4 e Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20: 2322-8) in varie condizioni patologiche, quali l'aterotrombosi (Stroke 2005;36:673-675), alcune malattie immuno-infiammatorie (J Thromb Haemost 2004;2:557-560) o il cancro (Clin Cancer Res 2004;10:610-614).
Di particolare interesse è, inoltre, l'osservazione epidemiologica che un aumento del CD40L possa essere in grado di predire prospetticamente l’evento cardiovascolare in giovani donne apparentemente sane (Circulation 2001;104:2266-68). Elevati livelli solubili di CD40L sono stati osservati in pazienti affetti da diabete mellito di tipo 1 e tipo 2 (Circulation 2003;107:1954-7 e Circulation 2003;107:2664-9) avvalorando ulteriormente l’ipotesi di un background comune tra la malattia ateroscleroica ed il diabete mellito (Eur Heart J 2002;23:831-4).
Studi sulla distribuzione cellulare del CD40L indicano che più del 95% del CD40L circolante sembra essere di derivazione piastrinica, forse rilasciata in seguito alla formazione del trombo in vivo (Nature 1998;391:591–4), ma non tutti gli autori sono d'accordo (Thromb Haemost 2005;93:578-583). L'attivazione piastrinica in vivo sembrerebbe, infatti, essere responsabile dell’incremento dei livelli plasmatici di sCD40L nel paziente con patologia coronarica acuta (N Engl J Med 2003;348:1104-11) o nell'ipercolesterolemia (Circulation 2002;106:399-402), ma non nella vasculopatia periferica (Thromb Haemost 2005;93:578-583). Attualmente, non vi sono dati disponibili sull’origine cellulare del sCD40L circolante nel paziente con T2DM. Pertanto, l'obiettivo che ci prefiggiamo con questa ricerca è quello di valutare se un incremento dei livelli circolanti di sCD40L nel T2DM possano derivare, almeno in parte, da una attivazione piastrinica trombossano-dipendente. A tale scopo ci proponiamo di condurre uno studio atto alla caratterizzazione del contributo piastrinico del CD40L nel paziente con T2DM e di valutare l’effetto del miglioramento del controllo metabolico e/o di una terapia con aspirina a basse dosi sul rilascio piastrinico di sCD40L.

Lo studio qui delineato si propone di verificare se i livelli elevati di sCD40L osservati nel paziente affetto da diabete mellito di tipo 2 (T2DM) possano essere dovuti ad un'attivazione piastrinica trombossano-dipendente e se questa possa essere modulata dal miglioramento del controllo metabolico e/o dal trattamento con aspirina a basse dosi.

A tale scopo sarà reclutato un campione di circa 80 pazienti con una diagnosi di T2DM in accordo con i criteri della American Diabetes Association (Diabetes Care 2003;26:1-156), che non abbia partecipato nei 2 anni precedenti a sperimentazioni cliniche controllate. Come gruppo di controllo verrà selezionato un campione di soggetti apparentemente sani omogenei per età e sesso con la popolazione sperimentale (Prof. Basili, Dott. Labbadia,Prof. Musca).
I principali criteri di esclusione dallo studio saranno rappresentati da almeno una delle seguenti condizioni: età inferiore a 18 e superiore a 70 anni; storia recente di eventi trombotici venosi ed arteriosi (<6 mesi); gravidanza o parto nei precedenti 6 mesi; trattamento concomitante con terapia ormonale; malattie infiammatorie acute in atto; malattie autoimmuni; neoplasie maligne; insufficienza renale e/o epatica; uso regolare di farmaci corticosteroidi, anti-infiammatori non steroidei (FANS), anti-aggreganti o anticoagulanti o complessi multivitaminici.
I pazienti verranno studiati allo scopo di valutare la presenza di complicanze micro e macrovascolari (sulla base della storia clinica e di una valutazione clinica e strumentale - Dott. Scarno, Sig. Libri, Dott. Turchetti) della malattia aterosclerotica. I pazienti che presentino una progressione significativa della malattia nei 6 mesi precedenti l’arruolamento non potranno essere considerati eleggibili.
L'eleggibilità dei pazienti sarà verificata da due esperti indipendenti dopo verifica della storia clinica e attenta revisione delle indagini diagnostico-strumentali (Prof. Davì).
Verrà eseguita una attenta raccolta dei dati rivolta soprattutto alla valutazione della durata della malattia, alla concomitanza di altri fattori di rischio della malattia aterosclerotica e alla terapia farmacologia antidiabetica.
Verrà definito come iperteso il paziente con valori di pressione arteriosa superiori a 130/85 (sistolica/diastolica) o in trattamento con farmaci anti-ipertensivi.
Verrà definito come ipercolesterolemico il paziente con valori di colesterolo totale superiori a 200 mg/dl o in trattamento con terapia ipolipidemizzante.
Ad ogni paziente verrà richiesto il consenso informato scritto per la partecipare allo studio.

Disegno dello studio
1)
Il primo studio sarà di tipo caso-controllo con un rapporto 1:1 disegnato allo scopo di valutare le differenze dei livelli circolanti di sCD40L ed i livelli urinari di 11-deidro-TXB2 (livelli urinari di un metabolita enzimatico del trombossano A2, indice di attivazione piastrinica in vivo) nel gruppo di pazienti rispetto al gruppo di controllo.
Tutti i soggetti verranno studiati ambulatorialmente, dopo un digiuno di almeno 12 ore, e dovranno astenersi dal fumo per almeno 2 ore prima dell’esecuzione del prelievo (Dott. D'Angelo). In ogni soggetto verranno prelevati campioni ematici allo scopo di misurare alcuni indici infiammatori, metabolici ed altri parametri biochimici (Dott. Ferroni, Dott. Magliocca, Sig. Principessa, Dott. Martini, Sig. Di Persio).
In particolare verranno valutati i livelli plasmatici circolanti di sCD40L utilizzando kits ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxford, UK) e quelli della proteina C reattiva utilizzando una metodica immuno-nefelometrica ad alta sensibilità (Ann Clin Biochem. 1998;35:745-753). Con metodi di routine, verranno dosati i livelli di glicemia (metodo ossidativo), di HbA1c (cromatografia), di colesterolo totale, colesterolo-HDL e trigliceridi.
Inoltre, ogni soggetto verrà istruito alla raccolta delle urine per la misurazione dei livelli urinari di 11-deidro-TXB2 utilizzando metodi radioimmunologici precedentemente validati. Infatti, è stata sviluppata nei laboratori dell’Università di Chieti-Pescara (Prof. Davì e Prof. Romano) una metodica radioimmunologica per la misurazione dell'11-deidro-TXB2 nelle urine. In tale metodica, validata attraverso il confronto con la gas cromatografia e la spettrometria di massa, aliquote da 40-50 ml ottenute dalle urine raccolte nelle 24 ore, o da campioni di urine del mattino, vengono conservate a - 20°C fino al momento dell'estrazione. L'escrezione urinaria di 11-deidro-TXB2 viene corretta per i livelli di creatinina nelle urine, in quanto il composto viene filtrato dal rene.
La numerosità campionaria attesa dei pazienti con diabete di tipo 2 sarà di circa 80 pazienti in un range temporale di arruolamento di 12 mesi.

2)
Allo scopo di valutare la potenziale influenza di un migliore controllo metabolico sui livelli di circolanti di sCD40L e su quelli urinari di 11-deidro-TXB2 verrà pianificato un secondo studio in quei pazienti nei quali non fosse evidente, al momento dell’arruolamento, un buon controllo metabolico (glicemia a digiuno> 200 mg/dL e HbA1c> 8%) nonostante l’impiego della terapia antidiabetica. Tali pazienti verranno riesaminati dopo 4 settimane nelle quali verrà modificato lo schema terapeutico, migliorata la dieta ipocalorica, implementata l’attività fisica e monitorati i livelli glicemici. Dopo queste 4 settimane verranno nuovamente valutati tutti i parametri biologi ematici ed urinari valutati al momento dell’ingresso nello studio.

3)
Allo scopo di valutare l’influenza di un trattamento a breve termine con aspirina a basse dosi (100 mg/die) verrà condotto uno studio pilota (terzo studio) in almeno 10 pazienti volontari, con un ottimo controllo metabolico, nei quali prima e dopo la terapia con aspirina verranno valutati i parametri dosati al momento dell’arruolamento. Tale gruppo includerà pazienti senza evidenza di manifestazioni macro o micro-vascolari della malattia aterosclerotica.

L’analisi statistica dei dati prevedrà l’impiego del t-test per dati non appaiati e del t-test per dati appaiati, del test del chi-quadro ed il test di correlazione di Pearson. Verrà usato un modello di regressione multipla. Nel caso di variabili con distribuzione non gaussiana (11-deidro-TXB2) si provvederà alla trasformazione logaritmica dei dati o si useranno tests statistici non parametrici. Tutti i tests saranno a 2 code e il livello di significatività scelto sarà del 5%. Per tutti i tests verrà usato il programma per computer SPSS versione 11.0 (Prof. S. Damiani).
Il risultato atteso, sulla base delle premesse sperimentali esposte in precedenza, è una differenza significativa dei livelli di sCD40L e di 11-deidro-TXB2 nel gruppo di pazienti diabetici rispetto al gruppo di controllo (primo studio), nonché una correlazione diretta tra questi 2 parametri. Inoltre, si prevede di poter ottenere una concomitante riduzione di sCD40L e 11-deidro-TXB2 in seguito ad un migliore controllo metabolico (secondo studio) e soprattutto dopo terapia con aspirina (terzo studio).

2001: Nessun finanziamento

Nel corso della ricerca afferente al Progetto di Ateneo 2003, dal titolo "Associazione tra stato infiammatorio ed attivazione piastrinica in pazienti con ipercolesterolemia. Effetti del trattamento con simvastatina od aspirina a basse dosi sui livelli circolanti di interleuchina-1beta" (Codice progetto: C26A035453), è stato effettuato uno studio diretto a verificare l’ipotesi che l’attivazione piastrinica possa rappresentare una fonte di interleuchina (IL) -1beta in pazienti affetti da ipercolesterolemia poligenica primitiva. A tale scopo è stato reclutato un campione di 50 pazienti con una diagnosi di ipercolesterolemia poligenica primitiva. I pazienti sono stati arruolati nello studio dopo un wash-out di almeno 2 mesi da terapia farmacologica e/o supplementi vitaminici e/o supplementi naturali che potessero interferire con il metabolismo lipidico. Tutti i pazienti arruolati sono stati valutati dopo 2 mesi di un regime dietetico controllato corrispondente allo STEP I dell’American Heart Association diet. Dopo tale periodo, e dopo aver firmato il consenso informato, i pazienti sono stati randomizzati ad uno dei seguenti trattamenti:
1) simvastatina 20 mg in una unica somministrazione per os alle ore 21.00 per 8 settimane (n=25)
2) aspirina 100 mg in una unica somministrazione per os alle ore 08.00 per 8 settimane (n=25)
L’analisi dei livelli basali medi di colesterolo, LDL-colesterolo, HDL-colesterolo e trigliceridi totali non mostrava differenze tra i due gruppi. Come atteso, il trattamento con aspirina a basse dosi non causava alcuna riduzione del colesterolo totale e di LDL-colesterolo nel corso delle otto settimane di trattamento, mentre un ciclo terapeutico a base di simvastatina era in grado di ridurre in maniera significativa sia il colesterolo totale (-25%, p<0.0001) sia i livelli di LDL (-31%, p<0.0001).
L'analisi delle correlazioni fra le variabili analitiche analizzate nello studio ha dimostrato che i livelli basali di sP-selettina (marker di attivazione piastrinica in vivo) erano direttamente correlati con i livelli di IL-1beta (rho= 0.64, p<0.0001) e proteina C-reattiva (CRP)(rho= 0.31, p<0.05), ma non con i livelli di fattore von Willebrand (marker di disfunzione endoteliale, p=0.32), di colesterolo totale (p=0.39) o di LDL (p=0.91). Queste osservazioni suggerivano che:
1. I livelli di IL-1beta sono strettamente correlati all’attivazione piastrinica in vivo e non ad una condizione di attivazione endoteliale
2. Un profilo lipidico alterato non sembra essere il determinante principale per un’aumentata produzione di IL-1beta nell’ipercolesterolemia.
Quindi, per analizzare ulteriormente il rapporto fra infiammazione ed attivazione piastrinica in questi pazienti, è stata eseguita un'analisi di regressione multipla comprendente tutte le variabili cliniche e di laboratorio. Il modello finale ottenuto ha messo in evidenza che sia la sP-selettina (coefficiente di regressione = 0.30, p< 0.02) sia i livelli Il-1beta (coefficiente di regressione b = 0.50, p< 0.0001) erano in grado di predire in maniera indipendente livelli elevati di CRP, a conferma della stretta associazione tra attivazione piastrinica ed infiammazione sub-clinica in pazienti con ipercolesterolemia.
La randomizzazione al trattamento sia con simvastatina sia con aspirina si è dimostrato in grado di ridurre in misura significativa sia i livelli di sP-selettina sia quelli di Il-1beta. Le modificazioni percentuali di IL-1beta e sP-selettina correlavano tra loro in maniera significativa sia in pazienti randomizzati a ricevere simvastatina (rho = 0.42, p<0.05) sia in quelli trattati con aspirina (rho = 0.42, p<0.05). Il trattamento con simvastatina era in grado di ridurre i livelli di CRP di circa 17% (p<0.05), mentre la terapia con aspirina non causava alcun cambiamento dopo otto settimane di trattamento. I livelli di fattore von Willebrand non mostravano alcuna variazione significativa con entrambi i trattamenti.
I risultati ottenuti confermano l'ipotesi che le piastrine possano rappresentare una fonte relativa di Il-1beta in pazienti con ipercolesterolemia. A sostegno di tale ipotesi sta l’osservazione sperimentale che la terapia con aspirina a basse dosi (disegnata per esercitare un effetto antiaggregante piastrinico, privo dell’azione anti-infiammatoria caratteristica dei dosaggi più elevati) è in grado di ridurre in simultaneamente la sP-selettina e l’IL-1beta. I risultati sovrapponibili ottenuti con la simvastatina confermano l’azione pleiotropica della molecola, e contribuiscono a spiegare l’osservazione epidemiologica di una riduzione precoce degli eventi cardiovascolari in trial clinici con statine in una fase in cui l’effetto ipolipemizzante non è ancora in grado di provocare la stabilizzazione della placca aterosclerotica.
In conclusione, i dati ottenuti confermano l’esistenza di una stretta associazione tra infiammazione e stato protrombotico nel paziente con ipercolesterolemia poligenica, e suggeriscono che la piastrina, attraverso le sue azioni infiammatorie, possa giocare un ruolo di rilievo nella fisiopatologia dell’aterosclerosi.

Ferroni P, Martini F, Cardarello CM, Gazzaniga PP, Davi G, Basili S. Enhanced interleukin-1beta in hypercholesterolemia: effects of simvastatin and low-dose aspirin. Circulation. 2003;108:1673-5.

I risultati ottenuti sono stati anche oggetto di discussione in:
Ferroni P, Basili S, Davi G. Platelet activation, inflammatory mediators and hypercholesterolemia. Curr Vasc Pharmacol. 2003;1:157-69; Ferroni P, Basili S, Falco A, Davi G. Oxidant stress and platelet activation in hypercholesterolemia. Antiox Redox Signal. 2004;6:747-56; Ferroni P, Basili S, Davi G. New insights in the pathogenesis of prothrombotic state associated with hypercholesterolemia. Recenti Prog Med. 2004;95:169-78.

SI