Le leucemia acuta linfoide (LAL) rappresenta le neoplasia ematologica di più frequente riscontro in età pediatrica, ed è altresì diagnosticata nell'adolescente, nell'adulto e nell'anziano. Sebbene le LAL siano citomorfologicamente assai simili, e’ ormai chiaro che vi e’ un alto grado di eterogeneità nell’ambito di questa patologia. L’analisi immunofenotipica consente di definire non solo la filiera di origine (T o B), ma anche di rifinire ulteriormente lo stadio di differenziazione della cellula leucemica. L’introduzione dell’analisi citogenetica/molecolare nell’inquadramento diagnostico delle LAL ha consentito di definire alterazioni cromosomiche che sono di frequente riscontro, i.e. la t(9;22) (BCR/ABL), la t(4;11) (ALL1/AF4) o altre anomalie che coinvolgono la regione cromosomica 11q23, la t(1;19) (E2A/PBX1) e la t(12;21) (TEL/AML1). L’identificazione di specifiche anomalie ha un rilevante impatto a livello prognostico, ed e’ ormai noto che alcune aberrazioni genetiche sono associate ad un andamento clinico assai sfavorevole (vedi BCR/ABL e riarrangiamenti dell’11q23), mentre altre, ed in particolar modo la TEL/AML1, sono associate ad una più elevata percentuale di guarigione. L’incidenza di tali aberrazioni è variabile nelle diverse decadi di vita: le anomalie a carico dell’11q23 sono relativamente rare, con un’incidenza di circa il 5-10% negli adulti, del 2-5% nei bambini, ma con un picco nei neonati (< 1 anno). La t(9;22) e/o la sua controparte molecolare sono presenti nel 25% degli adulti, e solo nel 2-5% dei bambini. Inoltre, la prevalenza dei riarrangiamenti BCR/ABL aumenta progressivamente con l’avanzare dell’età e si stima una percentuale del 40% negli individui con età superiore ai 55 anni. La t(12;21) (TEL/AML1) e’ l’alterazione genetica di più frequente riscontro nei bambini (25-30% dei casi) ed e’ virtualmente assente nelle casistiche di pazienti adulti.
Nelle ultime due decadi, la prognosi nel bambino e’ notevolmente migliorata ed in circa il 70% dei casi si ottiene la guarigione; nell’adulto, la percentuale di ottenimento della remissione completa (RC) si aggira intorno all’80%, ma il numero di pazienti che presentano una ricaduta di malattia rimane a tutt’oggi molto elevato. Recentemente, l’introduzione degli oligonucleotide arrays ha consentito notevoli avanzamenti nell’identificare patterns di deregolazione genica che sono strettamente associati a specifiche aberrazioni cromosomiche. In particolare, si sono evidenziate “signatures” correlate con la presenza del riarrangiamento ALL1/AF4, con E2A/PBX1 e con TEL/AML1, ed e’ stato possibile evidenziare potenziali bersagli di terapie mirate. L’esempio in tal senso più rappresentativo e’ costituito dalla tirosin-chinasi FLT3. Questo gene e’ stato spesso implicato nei meccanismi di leucemogenesi. Tanto nella leucemia acuta mieloide dell’adulto quanto del bambino, FLT3 e’ stato sovente trovato mutato e/o attivato. D’altra parte, tramite studi di gene expression profiling, e’ stato possibile documentare una alta espressione di FLT3 anche nei casi di LAL con riarrangiamenti a carico del gene ALL1. Questo dato ha avuto importanti risvolti terapeutici, considerando che inibitori diretti contro questo gene sono oggi disponibili ed attualmente in sperimentazione clinica. In letteratura, non vi sono studi mirati al confronto diretto del profilo di espressione genica tra adulti e bambini. Tuttavia, le analisi di confronto indiretto tra adulti e bambini con le stesse anomalie molecolari (applicazione di liste di geni identificate nelle casistiche pediatriche a pazienti adulti, o integrazione di dati derivati da casistiche e centri diversi) hanno evidenziato una stretta similitudine tra le due fasce di età laddove siano presenti i riarrangiamenti ALL1/AF4 ed E2A/PBX1, indicando un comune meccanismo biologico che e’ alla base della trasformazione maligna. Al contrario, le LAL che presentano la t(9;22) e/o la loro controparte molecolare BCR/ABL sono biologicamente e clinicamente eterogenee: tra i fattori che contribuiscono almeno in parte a tale eterogeneità vanno annoverati la presenza di almeno 3 tipi di proteine di fusione - p190, p210 e p230 - ed il diverso grado di differenziazione della cellula leucemica (trattasi più frequentemente di linfociti B common e pre-B, e più raramente pro-B). La prognosi in questo gruppo di pazienti è infausta con protocolli di chemioterapia standard a prescindere dalla fascia di età, anche se un sottogruppo pediatrico ha una prognosi più favorevole anche senza l’impiego di procedure trapiantologiche. Anche nell’adulto sono stati descritti con tecniche di PCR quantitativa pazienti BCR/ABL+ che dimostrano una buona clearance dei blasti dopo chemioterapia. Ciò suggerisce la presenza di caratteristiche biologiche aggiuntive responsabili della differente risposta alla chemioterapia, ancora non completamente delucidate. Anche in questo contesto, gli studi di gene profiling hanno corroborato i risultati precedentemente ottenuti: infatti, sebbene sia stato possibile identificare un pattern di espressione genica associato a tale aberrazione, e’ stato riscontrato un alto grado di eterogeneità in questo sottogruppo, sia nelle coorti pediatriche che adulte. Partendo dai risultati ottenuti da studi di gene expression profiling, e’stata effettuata una validazione basata sull’uso di metodiche di PCR qualitativa e/o quantitativa che ha evidenziato la presenza di un piccolo gruppo di geni differenzialmente espressi tra adulti e bambini. L’introduzione di inibitori specificamente diretti contro ABL – i.e. Imatinib (Glivec, Gleveec) – impiegati in combinazione con protocolli di chemioterapia, ha incrementato la percentuale di RC e la Disease-Free Survival (DFS).Risposte, anche complete, sono state osservate con il solo Imatinib anche in pazienti superiori a 60 anni Alcuni pazienti risultano tuttavia insensibili al trattamento con tale composto: i meccanismi di resistenza all’imatinib ad oggi maggiormente analizzati includono l’iperespressione del trascritto di fusione BCR/ABL e l’insorgenza di mutazioni a carico di ABL. La valutazione comparativa, mediante microarrays, di pazienti affetti da LAL BCR/ABL+ sensibili o resistenti al trattamento in vivo con Imatinib ha consentito di identificare un gruppo di geni associati alla resistenza a tale farmaco. Nuove molecole, come ad esempio AMN107 e BMS-354825, che in vitro presentano maggiore efficacia, sono in corso di sperimentazione clinica.

Nell’ ambito di questo studio multicentrico nazionale, lo sviluppo di questa estesa rete di caratterizzazione molecolare implica, come intuibile, la manipolazione di un ingente numero di campioni biologici. Tali campioni derivano dalle cellule leucemiche dei pazienti affetti da LAL ottenute all’esordio di malattia, cosi come durante la terapia di consolidamento e mantenimento, e nei follow-up successivi alla sospensione della terapia (circa 15 punti per ogni paziente da analizzare). Al fine di standardizzare al meglio l’intera caratterizzazione molecolare ed il monitoraggio della malattia minima residua, di ridurre la variabilità tra esperimenti, e di garantire un sistema robotizzato per l’estrazione degli acidi nucleici (DNA e RNA) e allestimento delle piastre di PCR quantitativa, diventa di estrema utilità l’uso di una apparecchiatura per l’automazione di tali procedure. Questo sarà indispensabile per il raggiungimento degli obiettivi di sotto elencati.

Arruolamento dei pazienti nel protocollo GIMEMA 0904
Lo screening di diagnostica molecolare, del profilo genomico e della valutazione della malattia minima residua verrà eseguito su tutti i campioni di sangue midollare o periferico di pazienti adulti con LAL arruolati dalle 60 Istituzioni di Ematologia partecipanti al gruppo Multicentrico Italiano GIMEMA (Gruppo Italiano per lo Studio delle Malattie EMatologiche dell'Adulto). Questo screening è reso possibile dal fatto già esiste un programma di centralizzazione dei campioni biologici prelevati alla diagnosi o a tempi prefissati durante il follow-up clinico dei pazienti presso l’Ematologia dell’Università “La Sapienza” di Roma. Questo programma è stato attivato nel 1996 nell’ambito dello studio GIMEMA sulle LAL dell’adulto 0496. L’esperienza condotta sino ad oggi ha chiaramente dimostrato che: i) un’elevata adesione da parte delle 60 Istituzioni partecipanti nell’invio dei campioni biologici dei pazienti allo studio; ii) l’esistenza di una rete organizzativa efficiente e tecnicamente valida per la raccolta e lo studio del materiale biologico dei pazienti.

Diagnostica molecolare e monitoraggio dei trascritti di fusione BCR/ABL, ALL1/AF4 o E2A/PBX1
Lo screening di diagnostica sarà eseguito molecolare mediante RT-PCR e sarà volto a identificare tutte le più comuni alterazioni genetiche associate alle LAL. Più precisamente saranno ricercati i seguenti trascritti di fusione: BCR-ABL p190 (e1a2), BCR-ABL p210 (b2a2 e/o b3a2), ALL1/MLL-AF4, ALL1/MLL-ENL, SIL-TAL1, E2A-PBX1, TEL-AML1, HLF-E2A and NUP98-GDS1 che sono rispettivamente associate alle traslocazioni t(9;22), t(4;11)(q22;q23), t(11;19), t(1;19), t(12;21), del (1p34) and t(4;11)(q22;p13). Per lo screening molecolare sarà impiegato un sistema di RT-PCR multiplex, derivato dal metodo descritto precedentemente da Pallisgard et al. e messo a punto nei laboratori della Sezione di Ematologia dell’Università "La Sapienza" di Roma. Questa metodica permette una rapida diagnosi dei geni di fusione sopramenzionati e costa di due step. Il cDNA sarà preparato da RNA totale mediante cDNA primers di 10-13 nucleotidi specifici ai trascritti di fusione amplificati e posizionati ad una distanza di 10-100 nucleotidi dal PCR primer più distale. Inoltre, per incrementare la sensibilità del metodo il sistema prevede una “nested PCR”. L’intera metodica consiste di due fasi. Nella prima saranno allestiti due tubi di reazione per l’amplificazione dei trascritti SIL-TAL1, E2A-PBX1, TEL-AML1, HLF-E2A e NUP98-GDS1 (tubo A), e BCR-ABL p190 (e1a2), BCR-ABL p210 (b2a2 e/o b3a2), ALL1/MLL-AF4, ALL1/MLL-ENL (tubo B). In ciascuna reazione saranno aggiunti gli opportuni nucleotidi per amplificare un frammento di 690 bp del gene E2A come gene di controllo interno della reazione. Qualora si sia ottenuto un prodotto di amplificazione in un delle due reazioni allestite durante la prima fase del test, nella seconda fase per la conferma e l’identificazione del prodotto ottenuto saranno allestite singole reazioni di PCR per l’identificazione dei geni contenuti nelle provette nella quale si è ottenuto il prodotto di amplificazione, impiegando gli stessi oligonucleotidi e parametri di reazione della RT-PCR multipla. Tutte le reazioni di amplificazione prevederanno l’allestimento degli opportuni controlli negativi in cui verranno miscelati tutti i reagenti ma senza cDNA. Con questa metodica potranno essere studiati i campioni relativi ai circa 120-140 nuovi pazienti che mediamente vengono arruolati per anno nei protocolli GIMEMA per le LAL dell'adulto.
In tutti i pazienti con LAL molecolarmente positivi il monitoraggio della malattia minima residua sia a livello clinico che molecolare verrà eseguito a tempi prefissati ed esattamente al termine del trattamento di induzione, di consolidamento e ogni due mesi durante il trattamento di mantenimento ed il follow-up successivo, mediante la determinazione dei livelli di espressione dei rispettivi geni di fusione, nei casi molecolarmente positivi. Il numero di copie dei trascritti di fusione sarà determinato mediante la metodica di Q-T-PCR sviluppata nell’ambito del programma europeo EAC standardizzata presso la “European Concerted Action of the Europe Against Cancer (EAC) Program”. Tutte le reazioni di amplificazioni verranno effettuate mediante l’apparecchiatura automatica ABI 7700 (Applied Biosystem). Il sistema di Q-RT-PCR in ciascun campione misura in tempo reale il numero di copie prodotte sia dall' RNA che codifica per i rispettivi trascritti di fusione che per il gene di controllo ABL per verificare campione per campione l’integrità dell’RNA. Per ciascun esperimento di amplificazione, verrà costruita un curva di calibrazione sia per il gene BCR/ABL, ALL1/AF4 o E2A/PBX1 che ABL, impiegando diluizioni seriali di plasmidi calibratori contenenti le sequenze target dei rispettivi geni. Il numero di copie dei geni BCR/ABL, ALL1/AF4 o E2A/PBX1 e ABL verrà calcolato rapportando il numero dei cicli di PCR nel quale si comincia ad evidenziare l’emissione di fluorescenza dovuta all’amplificazione del prodotto di amplificazione (ciclo soglia = Cs) con l’opportuna curva di calibrazione. I risultati per ciascun campione verranno espressi dal rapporto del numero di copie di BCR/ABL, ALL1/AF4 o E2A/PBX1 sul numero di copie di ABL. Tutte le reazioni di amplificazione verranno espresse in triplicato e per il calcolo del numero di copie verrà impiegato il Cs medio.

Valutazione dei riarrangiamenti dei geni delle immunoglobuline (Ig) e T-cell receptor (TCR) e monitoraggio della malattia residua.
Per i pazienti affetti da LAL che non presentano trascritti di fusione, dopo l’estrazione e la quantificazione del DNA genomico lo screening iniziale prevederà: 1) allestimento delle reazioni di amplificazione attraverso metodiche di PCR qualitativa (“Applied Biosystem 9700”), per valutare la presenza di riarrangiamenti della catena pesante e leggera delle Ig e della catena gamma e delta del TCR. Una volta eseguito l’intero screening, i campioni che hanno presentato una positività verranno sottoposti ad analisi di omo/eteroduplex, purificati e sottoposti ad analisi di sequenziamento; 2) ottenuta la sequenza delle regioni specifiche per ogni paziente, verrà eseguito il disegno degli ASO (Allelic Specific Oligonucleotide) attraverso i supporti informatici “Primer Express ABI PRISM Primer Design e Software” e “OLIGO 6”; 3) lo step finale consisterà nella valutazione della malattia minima attraverso l’allestimento di tre piastre, usando lo strumento di real-time quantitativa ABI PRISM 7700 Sequencer Detector:
a) piastra per i preliminari: si allestisce per testare la sensibilità degli oligonucleotidi ASO che sono stati disegnati, in combinazione con sonde TaqMan e primers reverse in configurazione germinale;
b) piastra per la valutazione dell’Albumina (gene di controllo): si allestisce questa piastra per testare la qualità dei campioni di cui dobbiamo valutare la malattia minima;
c) piastra per la quantificazione: viene allestita con quei marcatori che negli studi preliminari hanno dato maggiore sensibilità, sempre attraverso l’uso di sonde TaqMan e primer reverse in configurazione germinale.

Valutazione del profilo genomico dei pazienti con LAL all’esordio di malattia
La separazione del materiale leucemico da analizzare verrà eseguita con metodiche standard, ovvero mediante gradiente di densità (Lymphoprep). Al momento, non sono previste separazioni immuno-magnetiche, poiché la popolazione residua contaminante e’ generalmente scarsa (<25%).
Gli acidi nucleici verranno estratti partendo da cellule leucemiche di sangue periferico o midollare a seconda della percentuale di blasti del campione.
L’RNA viene oggi estratto secondo procedure standard, mediante l’impiego del TRizol (Gibco) e ulteriore purificazione con kit commerciali (SV Total RNA Isolation System, Promega). Nel caso in cui i campioni fossero ipocellulari, le procedure di ulteriore purificazione non verranno effettuate: questo al fine di ridurre la perdita di RNA.
Preparazione dell’RNA target e gene expression profiling. Uno dei maggiori problemi relativi alla tecnologia dei microarrays e’ rappresentato dalla presenza di numerose fonti di variabilità. Sebbene sia stato recentemente dimostrato che in alcuni sottogruppi di leucemie acute non vi sono differenze rilevanti attinenti la diversa processazione dei campioni (come ad esempio invio, separazione e criopreservazione delle cellule da analizzare, e qualità dell’RNA), e’ altresì tassativo garantire una procedura quanto più possibile uniforme. Al fine di evitare fonti di variabilità di tipo tecnico, in tutti gli esperimenti vengono impiegati 5 microgrammi di RNA totale, che servono da template per la sintesi del DNA complementare (cDNA). Per la sintesi del cDNA a doppia catena, la generazione di RNA complementare biotinilato e la frammentazione di quest’ultimo, vengono impiegati kit commerciali distribuiti da Affymetrix. Il genechip viene ibridizzato per circa 16 ore, lavato e coniugato con anticorpi fluoresceinati, seguendo le istruzioni suggerite da Affymetrix (www.Affymetrix.com). La strumentazione necessaria per la completa processazione dei genechips, e’ allocata e funzionale presso il nostro Istituto.
L’analisi statistica rappresenta una delle parti piu’ complesse e laboriose del gene expression profiling. Nelle precedenti procedure sperimentali (i.e. Northern blotting, PCR qualitativa e quantitativa), un numero limitato di geni veniva investigato in un un gruppo piu’ o meno ampio di pazienti; al contrario, la tecnica dei microarrays implica l’acquisizione di informazioni quantitative relative all’espressione di un elevato numero di geni in una casistica di pazienti relativamente ristretta. Come intuibile, questo sovvertimento della strutturazione dei metodi sperimentali implica obbligatoriamente la necessita’ di designare nuovi sistemi per l’analisi dei dati acquisiti. Per tale motivo, numerosi software sono stati ideati esclusivamente per l’analisi dei dati di gene expression profiling, e sono stati recentemente impiegati anche per la DNA analysis (vd. sopra, SNPs) e la proteomica. Tali programmi si basano generalmente sulla combinazione di nozioni prettamente statitistiche con infomazion di tipo bioinformatico. In questo studio, verranno utilizzati diversi software, con lo scopo di adempiere a piu’ funzioni: per la normalizzazione - processo finalizzato alla standaridzzazione di tutti gli esperimenti e alla minimizzazione della variabilita’ intersperimentale- e per la selezione di geni che presentino un sufficiente grado di espressione e di variabilità, verrà impiegato il programma DNA-chip analyzer (www.dchip.org). Per l’analisi statistica verrà utilizzato l’R-package (www.r-project.org), che consente di effettuare diversi tests, come ad esempio il t-test, l’analisi della varianza (ANOVA), la false discovery rate (FDR), il p-value adjustment, ecc. Questi test statistici rivestono estrema importanza nel ridurre la possibilita’ di selezionare geni solo “casualmente” significativi, fenomeno che si verifica quando il numero di variabili in esame e’ estremamente elevato. In aggiunta, verranno utilizzati altri programmi (Cytoscape, www.cytoscape.org, e GenMapp, www.genMAPP.org) per l’esplorazione di pathways funzionali e l’integrazione di essi con i dati di gene expression profiling.
I risultati ottenuti verranno validati fondamentalmente mediante l’esplorazione e l’analisi dei dati già pubblicati in letteratura, e disponibili on-line; inoltre i risultati ottenuti verranno convalidati mediante l’impiego di metodiche diPCR quantitativa. Tali approcci verranno utilizzati per l’identificazione di differenze significative nelle diverse fasce d’età, e per la correlazione di tali differenze con l’andamento clinico ed i parametri prognostici già noti.

Analisi del valore prognostico e del significato clinico della caratterizzazione molecolare e genomica e del monitoraggio della malattia minima residua.
Il significato clinico-prognostico della caratterizzazione molecolare e dei sottogruppi identificati tramite il profilo di espressione genica e la cinetica di riduzione della malattia minima residua saranno correlati con le altre caratteristiche biologiche e cliniche valutate all’esordio di malattia e analizzate con i metodi statistici appropriati (chi quadro o “Fisher’s test) e con analisi multivariata. Saranno valutati i seguenti obiettivi:
1) Risposta al trattamento d’induzione, consolidamento, post-consolidamento ed all’eventuale trapianto di CSE;
2) Durata della prima RCematologica e della risposta molecolare
3) Durata della sopravvivenza libera da malattia (DFS) calcolata dalla prima RCematologica
4) Durata delle sopravvivenza globale calcolata dalla diagnosi di malattia.

N. 1 MAGNA PURE LC INSTRUMENT.

DESCRIZIONE

1. L'Estrattore: Strumento automatico per l'isolamento e la purificazione degli acidi nucleici (DNA, RNA, mRNA) da un'ampia varietà di campioni di partenza come: sangue, cellule bianche, sangue periferico, cellule mononucleari, colture cellulari, tessuti (per DNA/RNA).
Il principio di estrazione e di purificazione degli acidi nucleici si basa su particelle magnetiche. La separazione degli acidi nucleici avviene utilizzando il magnete ad alta temperatura (il heating block è a 70°C). Alla fine dell'estrazione il campione è conservato a 4°C (il storage block- 4°C).
L'estrazione elimina tutte le tracce di eventuali inibitori della PCR.
Può estrarre fino a 32 campioni/run.

2. Il Preparatore: (completamento automatico)
L'accuratezza del pipettaggio e l'automatizzazione del procedimento ha per conseguenza un set-up di qualità superiore ad un set-up manuale (con alta riproducibilità) ideale per la PCR quantitativa.
Grande flessibilità del preparatore che può distribuire, prima i campioni, e poi realizzare il set-up della PCR o RT-PCR: in capillari (per il lightcycler) o/e in piastra per la PCR da 96 wells da 0.2 ml. Tutto il set-up viene fatto a temperatura controllata (7,5°C).

Per questo motivo, il MagNa Pure può essere utilizzato ed abbinato a tutti gli strumenti per la "real time" PCR.

SPECIFICHE TECNICHE

- Sistema completamente automatizzato per estrazione e set-up PCR.

- Innovativo con tecnologia di estrazione basata sulle particelle magnetiche. Alta qualità e riproducibilità del sistema di estrazione del DNA RNA e mRNA per il Lightcycler e/o tutti gli altri strumenti per la PCR qualitativa e quantitativa.

-Flessibile Post-Elution che si può realizzare in piastre standard 96 da 0,2 ml per PCR o in capillari del LC.

- Clot Detection per evidenziare la formazione dei precipitati e Tip Loss (la perdita di un puntale) che provoca l’arresto dell’estrazione.

- Il MagNa Pure è munito di un sistema di prevenzione delle cross-contaminazioni costituito da:

• Sistema di recupero gocce (Drop catcher), che impedisce l'eventuale perdita di gocce durante i movimenti del braccio del robot.
• Sistema chiuso (porta con chiusura attivata dal software)
• Lampada a UV per la decontaminazione della camera del MagNa Pure LC dagli acidi nucleici (programma di decontaminazione attivato dal software)
• Il sistema di estrazione (magnete) non richiede né pompe a vuoto, né centrifugazione che possono provocare cross-contaminazione
• I reagenti utilizzati, come la plastica, sono tutti Rnase free

-Veloce

Numero dei campioni: 1-32 in # 1 ora
Volume campioni: 200-300 µl
Volume puntali: 5-1000 µl
Volume eluizione: 25-200 µl
Accuratezza: minore del 3% da 5 – 10 µl
Circa 2% da 10 – 1000 µl
Target nucleic acid: DNA, RNA, nRNA

- Sistema pronto per l’uso “ready to go”, con protocolli ottimizzati e standardizzati memorizzati nel software: RNA, DNA mRNA da diverse fonti: colture cellulari, sangue intero o cellule del sangue, tra poco tessuti…

- Il robot MagNa Pure è sotto controllo del software, che comanda:

• inserimento dei dati (campioni)
• memorizzazione dei dati
• controllo dell’estrazione e del set-up

- Specifiche strumentali

Dimensione senza PC: 900(w) x 600(d)x650(h) mm
Peso: 151 Kg
Computer: Pentium PC con Windows 2000
Potenza: AC 90-240 Volt, 10°, 50, 60 HZ
Consumo: Massimo 1000 VA

- Tempo necessario:
Processa da 1 a 32 differenti campioni da meno di 1 ora a 1 ora e mezzo a seconda dei protocolli (54 min per il DNA, # 80 min per RNA da sangue o culture cellulari, 90 min per Total nucleic Acid, 95 min per mRNA).

L’apparecchiatura robotizzata verrà impiegata nell’ambito del progetto di ricerca proposto per l’estrazione automatizzata degli acidi nucleici (DNA & RNA) e per l’allestimento delle procedure di RT-PCR e di Q-RT-PCR dai campioni di sangue midollare e/o periferico dei pazienti con LAL arruolati nel protocollo multicentrico Italiano GIMEMA 0496. Questo studio contempla un programma di centralizzazione dei campioni biologici presso i laboratori della Sezione di Ematologia del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, dell’Università “La Sapienza” di Roma da parte delle circa 60 Istituzioni di Ematologia Italiane che aderiscono al gruppo GIMEMA. L’esperienza consolidata dei precedenti studi di questo gruppo, permette di prevedere un arruolamento annuo di circa 140 nuovi pazienti. Per quanto riguarda, invece, il controllo della malattia minima residua è prevedibile che per ciascun paziente dovranno essere studiati circa 15 campioni, distribuiti al termine dei trattamenti di induzione e consolidamento, durante la terapia di mantenimento ed il successivo follow-up clinico. L’analisi di questi numeri indica chiaramente la necessità di automatizzare tutte le procedure di lavorazione dei campioni biologici. I campioni pervenuti nei laboratori della Sezione di Ematologia dell’Università “La Sapienza” di Roma, dovranno essere quindi processati presso i laboratori della Sezione diretta dal Prof. Roberto Foà. L’apparecchiatura richiesta sarà utilizzata per l’estrazione degli acidi nucleici (DNA e RNA) e per la successiva valutazione della presenza dei trascritti di fusione BCR/ABL, ALL1/AF4 e E2A/PBX1 e dell’assetto del profilo genomico dei blasti leucemici secondo le metodologie già precedentemente dettagliate.
Il gruppo della Dott.ssa Anna Guarini utilizzerà l’apparecchiatura per l’allestimento delle PCR per la caratterizzazione dei riarrangiamenti dei geni delle Ig e del TCR. In questa maniera, verranno identificate delle sonde paziente specifiche, che potranno essere utilizzate per il monitoraggio della malattia minima residua mediante l’impiego di tecniche di Q-RT-PCR, che saranno allestite sempre attraverso l’uso della predetta apparecchiatura.
Il Prof. Agostino Tafuri si occuperà delle correlazione tra i parametri della caratterizzazione molecolare e dati di cinetica cellulare.
Il Prof. Pietro Martino, la Prof.ssa Giovanna Meloni ed il Dott. Maurizio Martelli seguiranno le problematiche cliniche del progetto con particolare riferimento ai pazienti adulti con LAL linfoide. La Dott. Anna Maria Testi, seguirà le problematiche cliniche inerenti i pazienti adolescenti o giovani adulti arruolati nello studio GIMEMA 0904.